Ténor italien, né le 24 juillet 1921 à Motta Santa Anastasia, un village près de Catania sur l'île de la Sicile.
Sa famille fait de gros sacrifices pour qu'il puisse suivre des cours de chant au séminaire de la rue Avialdo à Milan où il veut devenir prêtre. Il se présente et gagne à deux concours de chant l'un à Milan et l'autre à Florence en 1938. Pendant cette époque, il chante, également, dans divers cafés, restaurants (Odeon, Milan) et des cinémas (Cristallo, Milan).
En 1940, il a comme professeur le baryton Luigi Montesanto, mais la guerre vient interrompre ses études. Pendant trois ans, il est prisonnier en Allemagne ; il s'échappe en 1943, passe en Suisse où il est accueilli dans un camp de réfugiés à Vidy (près de Lausanne) et il est remarqué lors d'une émission réalisée en direct du camp. La direction de Radio-Lausanne obtient qu'il puisse travailler sa voix et participe à certaines émissions.
À la fin de la guerre, il revient à Milan et reprend ses leçons avec Montesanto. Il enregistre des chansons italiennes en avril 1946, sous le nom de Nino Florio. Puis quelques jours plus tard, et avec l'aide de Liduino Bonardi, un directeur réputé, il fait son début professionnel au Théâtre municipal de Reggio Emilia le 20 avril 1946 dans le rôle de Des Grieux dans Manon de Jules Massenet.
Il devait bientôt être connu dans l'ensemble de l'Italie et apparaître en 1946 à Venise (Les Pêcheurs de Perles), Genova(Rigoletto), Lugo (L'Ami Fritz, Rigoletto, La Traviata), Reggio Emilia (L'ami Fritz), à Bologne (La Somnambule) Piacenza (Manon) Ravenne (Manon, La Traviata) et Cesena (Manon). Il est également apparu au Liceu à Barcelone ouvrant la saison avec Manon en mars, La Somnambule et Rigoletto en décembre et janvier 1947. De 1948 à 1951, il obtient d'énormes succès au Met (Metroplolitan Opera).
Sa carrière triomphale commence en septembre 1951 avec une rencontre spectaculaire entre Giuseppe di Stefano, Maria Callas et Tito Gobbi. Une autre soirée spectaculaire a lieu en mai l'année suivante au Palacio de Bellas Artes à Mexico, quand Di Stefano chante encore avec Callas dans Les Puritains. Noël 1952, ils sont ensemble à Milan pour La Gioconda à La Scala Un grand moment dans sa carrière est venu avec Lucia di Lammermoor dirigée par Herbert von Karajan à la La Scala en janvier 1954. Lucia est jouée par Maria Callas. Il faut citer l'enregistrement célèbre de Tosca sous la direction de Victor de Sabata, cette fois avec Callas et Tito Gobbi, complétés par l'enregistrement renommé du Requiem de Verdi en août 1953 (répété en juin 1954 à Vérone avec comme solistes : Di Stefano, Schwarzkopf, Dominguez et Siepi.
L'Opéra de Vienne, Covent Garden, Paris, Chicago, San Francisco, Mexico, Buenes Aires, Rio de Janeiro et Johannesbourg se l'arrachent. Il participe au Festival de Vérone (1950) : Les Pêcheurs de Perle de Bizet.
Durant des années, sa carrière sera liée à celle de Maria Callas dont il est le partenaire principal et enregistre un très grand nombre de disques. Sa voix naturelle de ténor verdien s'assombrit. Berlin-Ouest l'engage pour chanter Le Pays du Sourire qui remporte un réel succès et l'ouvrage sera représenté dans toute l'Amérique du Nord.
Il retrouve Maria Callas pour mettre en scène Les Vêpres Siciliennes pour la réouverture du Théâtre Régio de Turin puis pour effectuer une tournée de concerts qu'ils interrompent brusquement en 1974. En juin 1992, il a chanté le rôle de l'empereur dans Turandot au Caracalla à Rome.
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